包纳米虫（Bona）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）E01一管式

请于-20℃条件下保存，有效期15个月

  ◆   产品说明

动物病害检测系列可针对食品、动物组织等样品中病原的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于包纳米虫（Bona）的检测，检出限为101copies/μL基因组DNA。

◆   产品组成（48测试）

◆   适用仪器

ABI 7500、Gentier 32R、Gentier 48E/48R、CFX96、Mx3005P、LineGene9600等实时荧光PCR仪。

◆  自备耗材和仪器

①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤电子天平；⑥金属浴；⑦均质机、搅拌机或研钵等研磨器具。

◆  注意事项

1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。

1）  第一区：样本制备区。

2）  第二区：模板添加区。

3）  第三区：扩增及产物分析区。

★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。

2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。

3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒。

5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。

7．本试剂盒仅供研究使用，不用于临床诊断。

◆  样品处理

参照《SC/T 7205.1-2007 牡蛎包纳米虫病诊断规程 第1部分:组织印片的细胞学诊断法》标准处理样品，制

备的样本保存待用。

详细步骤请按照标准操作。

◆   实验操作

1.         模板制备（样本制备区）

建议使用水生动物病原体基因组提取试剂盒系列等商品化试剂盒，具体过程详见产品说明书。

2.         添加模板（模板添加区，放置于冰盒上进行）

剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30秒后打开管盖，向每管反应液中分别加入5μL模板，顺序为NG-P、待测样品模板、PG-Bona-P。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30秒，离心1分钟，立即进行PCR扩增反应。

3.         扩增反应（扩增及产物分析区）

使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择NONE。

按下列条件设置扩增反应：

其他仪器请参照仪器说明书进行设置。

1.         基线和阈值设定

基线调整取3-15个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点。

◆   结果判定

1、质量结果判定

1）阴性对照：FAM荧光通道Ct值>45，无“S”型扩增曲线

2）阳性对照：FAM荧光通道Ct值≤30，曲线呈“S”型扩增曲线

上述两项若有一项不符合，应重新进行扩增；如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。

2、检测结果判定

1）测试样品检测Ct值≥45或无Ct值，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可判定样品不含有包纳米虫（Bona）或含量低于检出限；

2）测试样品检测Ct值≤40，曲线呈“S”型扩增曲线，可判定样品含有包纳米虫（Bona）；

3）测试样品检测Ct值在40～45之间，应调整模板浓度，重做实时荧光PCR。再次扩增后的样品检测Ct值＜45，则可判定样品含有包纳米虫（Bona）；再次扩增后的样品检测Ct值≥45，则可判定该样品不含有包纳米虫（Bona）或含量低于检出限。

★ NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。

参考结果图

◆  企业信息

广州双螺旋基因技术有限公司            网址：www.dhelix.cn

电话：020-85671013                          传真：020-34037175