恒温PCR法检测非洲猪瘟操作流程详细图文讲解
发布日期:2019年07月12日 阅读量:越来越多屠宰场、养殖场购进仪器进行非洲猪瘟的自检,如何快速掌握非洲猪瘟检测方法,提高工作效率?本视频中提供恒温PCR法检测非洲猪瘟操作流程,以供学习参考;恒温PCR法具有准确、快速、操作便捷等特点,适合养殖场、屠宰场、冷冻厂、肉食品加工厂等基层单位,进行非洲猪瘟自检工作,防控非瘟疫情,保障肉食品安全。
实验中采用双螺旋基因 Dhelix Q5 恒温荧光PCR检测仪以及北京森康非洲猪瘟病毒lamp检测试剂盒,检测样品包括猪肉组织、肉制品、饲料、血液。
一、采样及样品前处理
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病灶或疑似病灶组织
1、用无菌剪、镊采集待检脏器或肌肉组织(尽量避免采集脂肪组织),剪取待检样品2 g于研钵中充分研磨,装入无菌采样袋,加入10mL的生理盐水充分混匀。(固体样品和生理盐水比例为1:5)
2、对处理的组织匀浆液待检样品置70℃,30 min灭活后,取1ml研磨液到新的1.5ml的离心管,离心5 min,取上清液作1:10稀释,编号备用。
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饲料样品:
1、取粉碎后的饲料成品或原料2g,装入无菌采样袋,加入10mL的生理盐水充分混匀。(固体样品和生理盐水质量体积比为1:5)。
2、 取1毫升样品均质液,离心5分钟,取上清液作1:10稀释,编号备用。
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全血(推荐)
1、用无菌抗凝血真空管从颈静脉、前腔静脉、耳缘静脉采集猪血液<5mL,颠倒混匀,转移2ul至离心管中,加20ul双蒸水作1:10稀释,编号。
二、配液及加样
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1、解冻
取出检测试剂盒里的组分管,解冻2min,离心20s。放置在PCR低温冰盒上。
![](http://img.xiumi.us/xmi/ua/JaGq/i/8657c490496f3da2e952047ebee46876-sz_21286.png?x-oss-process=image/resize,w_1080/auto-orient,1/crop,x_0,y_0,w_390,h_338)
2、配液
取出一个1.5mL的离心管标记为“混”,向其中加入反应液及Bst 酶,加入量如下:
反应液:22μL × (n+2)
Bst 酶:1.5μL × (n+2)
(注,n为待检样品数)
配制成预混液,涡旋混匀,离心20秒。
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3、分装
取出n+2个PCR管,分别向里面分装23μL的预混液。
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4、密封
向每管装有预混液的PCR管中悬空滴入一滴矿物油(一滴约20 μL )。
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5、加样
向PCR管中加入2μL待检样品或阴/阳性对照,并在PCR管盖上做好相应标记,(加样顺序:阴性对照、样品、阳性对照)。瞬时离心,转移至上机区。
三、上机
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1、打开Q5动物疫病检测仪,等仪器温度上升到63℃后,点击“新建”;
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2、输入实验名称,可以以“日期+检测次数+检测人员姓名”的方式命名。
![](http://img.xiumi.us/xmi/ua/JaGq/i/f6bb4b6c9815cf4dec3645e957a022e3-sz_148543.png)
3、选择反应时间,60分钟;
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4、放入检测管,盖好盖子;
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5、编辑样品孔:打开“编辑”,在每个孔位写入样品名称,关闭编辑等待结果。
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6、点击开始“检测”;
四、结果判读
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质控标准:
1、阴性对照无扩增曲线,检测界面为“-”。
2、阳性对照出现典型的扩增曲线,检测界面为“+”。
如阴性和阳性对照不满足以上条件,此次实验视为无效。
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样品结果判读:
阴性:无特征性扩增曲线,检测界面为“-”,表明样品为阴性。
阳性:出现典型的扩增曲线,检测界面为“+”表示样品为阳性。