恒温PCR法检测非洲猪瘟操作流程详细图文讲解
发布日期：2019年07月12日 阅读量：越来越多屠宰场、养殖场购进仪器进行非洲猪瘟的自检，如何快速掌握非洲猪瘟检测方法，提高工作效率？本视频中提供恒温PCR法检测非洲猪瘟操作流程，以供学习参考；恒温PCR法具有准确、快速、操作便捷等特点，适合养殖场、屠宰场、冷冻厂、肉食品加工厂等基层单位，进行非洲猪瘟自检工作，防控非瘟疫情，保障肉食品安全。
实验中采用双螺旋基因 Dhelix Q5 恒温荧光PCR检测仪以及北京森康非洲猪瘟病毒lamp检测试剂盒，检测样品包括猪肉组织、肉制品、饲料、血液。
一、采样及样品前处理
病灶或疑似病灶组织
1、用无菌剪、镊采集待检脏器或肌肉组织（尽量避免采集脂肪组织），剪取待检样品2 g于研钵中充分研磨，装入无菌采样袋，加入10mL的生理盐水充分混匀。（固体样品和生理盐水比例为1:5）
2、对处理的组织匀浆液待检样品置70℃，30 min灭活后，取1ml研磨液到新的1.5ml的离心管，离心5 min，取上清液作1:10稀释，编号备用。
饲料样品：
1、取粉碎后的饲料成品或原料2g，装入无菌采样袋，加入10mL的生理盐水充分混匀。（固体样品和生理盐水质量体积比为1:5）。
2、 取1毫升样品均质液，离心5分钟，取上清液作1:10稀释，编号备用。
全血（推荐）
1、用无菌抗凝血真空管从颈静脉、前腔静脉、耳缘静脉采集猪血液＜5mL，颠倒混匀，转移2ul至离心管中，加20ul双蒸水作1:10稀释,编号。
二、配液及加样
1、解冻
取出检测试剂盒里的组分管，解冻2min，离心20s。放置在PCR低温冰盒上。
2、配液
取出一个1.5mL的离心管标记为“混”，向其中加入反应液及Bst 酶，加入量如下：
反应液：22μL × （n+2）
Bst 酶：1.5μL × （n+2）
（注，n为待检样品数）
配制成预混液，涡旋混匀，离心20秒。
3、分装
取出n+2个PCR管，分别向里面分装23μL的预混液。
4、密封
向每管装有预混液的PCR管中悬空滴入一滴矿物油（一滴约20 μL ）。
5、加样
向PCR管中加入2μL待检样品或阴/阳性对照，并在PCR管盖上做好相应标记，（加样顺序：阴性对照、样品、阳性对照）。瞬时离心，转移至上机区。
三、上机
1、打开Q5动物疫病检测仪，等仪器温度上升到63℃后，点击“新建”；
2、输入实验名称，可以以“日期+检测次数+检测人员姓名”的方式命名。
3、选择反应时间，60分钟；
4、放入检测管，盖好盖子；
5、编辑样品孔：打开“编辑”，在每个孔位写入样品名称，关闭编辑等待结果。
6、点击开始“检测”；
四、结果判读
质控标准：
1、阴性对照无扩增曲线，检测界面为“－”。
2、阳性对照出现典型的扩增曲线，检测界面为“＋”。
如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。
样品结果判读：
阴性：无特征性扩增曲线，检测界面为“－”，表明样品为阴性。
阳性：出现典型的扩增曲线，检测界面为“＋”表示样品为阳性。
